Χαρτογραφώντας το Pap test: Η Ελληνική καινοτομία στη διαγνωστική μικροσκοπία του Pap test!

Το PAP TEST αποτελεί διαχρονικά μια πολύ σημαντική εξέταση στα πλαίσια του προληπτικού ελέγχου στο γενικό πληθυσμό για την έγκαιρη εντόπιση νεοπλασματικών-προδιηθητικών αλλά και εγκατεστημένων καρκινικών αλλοιώσεων σε παραμελημένες περιπτώσεις του κολποτραχηλικού επιθηλίου. Η ανίχνευση των κυτταρομορφολογικών χαρακτηριστικών που συνδέονται με την έκθεση του επιθηλίου στον ιό του ανθρώπινου θηλώματος (HPV) και ιδιαίτερα των υψηλού κινδύνου για καρκινογένεση στελεχών του (HighRisk types) αποτελεί το ουσιαστικό στοιχείο στη διαγνωστική του PAP TEST. Παρά την καταλυτική του συμβολή στη συστηματική εξέταση του γυναικολογικού γεννητικού συστήματος, κατά τις τελευταίες δεκαετίες αναδείχθηκαν αδυναμίες της μεθόδου που αφορούν σε παραμέτρους τεχνικής φύσεως όπως η διαδικασία της λήψης (ποσότητα και ποιότητα λαμβανόμενου δείγματος με διάφορη αντιπροσώπευση του κολποτραχηλικού επιθηλίου), η διαδικασία μονιμοποίησης–χρώσης του δείγματος, η διαγνωστική μικροσκόπηση για την κατάδειξη παθολογικών κυττάρων και εν τέλει η ερμηνεία των κυτταρομορφολογικών ευρημάτων επί του πλακιδίου. Η τελευταία πολλές φορές επιδέχεται διαφορετικές διαγνωστικές αποχρώσεις καθώς δεν υπάρχει διαθέσιμη η ολότητα και ασφάλεια του ιστού παρά μόνο μεμονωμένα ή μικρές ομάδες κυττάρων άτακτα διαστρωματοποιημένων επί του πλακιδίου, απότοκος της κυτταρολογικής λήψης. Κατά συνέπεια υπάρχει υποκειμενικότητα στην εκτίμηση των ερμηνειών και "γκρίζες"ζώνες λόγω της σχετικής αβεβαιότητας, στοιχεία όμως αποδεκτά σύμφωνα με τα διεθνή δεδομένα.

Το παραπάνω κοινά αποδεκτό πρόβλημα δημιουργεί ένα κενό στην καθημερινή πρακτική της διαγνωστικής κυτταρολογίας και ειδικότερα στο PAP TEST και αποτέλεσε ως εκ τούτου το αντικείμενο μιας πρόσφατης εγχώριας διεπιστημονικής συνεργασίας με σκοπό την εξεύρεση μιας αποδοτικής και προσιτής λύσης αντιμετώπισής του. Ειδικότερα αναλήφθηκε η πρωτοβουλία και  αναπτύχθηκε για το σκοπό αυτό μια συστηματική ερευνητική συνεργασία μεταξύ του Ερευνητή του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών (ΕΙΕ) Δρ. Χρήστου Ριζιώτη και του Δρ. Ευάγγελου Τσιάμπα, ο οποίος είναι Στρατιωτικός Ιατρός – Κυτταρολόγος, MD, MSc, PhD, εκλεγέντας Λέκτορας Κυτταρολογίας-Μοριακής Βιολογίας – Επ. Συνεργάτης Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ, Harvard Medical School, Dept of CME affiliate-EACR/IASCL member.

Στο Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών η συνεργασία αυτή υλοποιήθηκε στα πλαίσια της δραστηριότητας "Εφαρμοσμένη Φωτονική - Υλικά και Διατάξεις" (Υπεύθυνος Ερευνητής Δρ. Χρ. Ριζιώτης) του Προγράμματος "Φωτονική για Νανοεφαρμογές"του Ινστιτούτου Θεωρητικής και Φυσικής Χημείας (ΙΘΦΧ). Στο ερευνητικό-εκτιμητικό σκέλος η υλοποίηση της συνεργασίας υποστηρίχθηκε σημαντικά σε επίπεδο εξοπλισμού και αναλωσίμων από την Εταιρεία Διαγνωστικών Αντιδραστηρίων και Ιατρικών μηχανημάτων MENARINI DIAGNOSTICS GREECE.

Η πρωτογενής ιδέα αντιμετώπισης του προβλήματος της μη-ελεγχόμενης και αποδοτικής σάρωσης στην μικροσκοπική κυτταρολογική διάγνωση εστιάστηκε στην ανάπτυξη ενός ορατού τετραγωνικού πλέγματος (grid) επί της καλυπτρίδας του πλακιδίου το οποίο θα καθοδηγεί τη μικροσκοπική παρατήρηση του Κυτταρολόγου ώστε να καλύπτεται διαγνωστικά η ολότητα του χρωσμένου δείγματος σε σύντομο χρονικό διάστημα αφαιρώντας την επιβεβαιωμένη πιθανότητα της μη οπτικής ολοκληρωτικής του σάρωσης. 

H σχετική τεχνολογία πλέγματος απέκτησε δίπλωμα ευρεσιτεχνίας στον Οργανισμό Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας (ΟΒΙ), και είναι σε διεθνή αίτηση PCT διεθνούς διπλώματος ευρεσιτεχνίας. Τα σχετικά ερευνητικά αποτελέσματα από την πιλοτική χρήση της νέας αυτής διαγνωστικής πλατφόρμας έχουν πρόσφατα παρουσιαστεί στο διεθνές συνέδριο Φωτονικής: SPIE Photonics Asia (12-14 Οκτωβρίου 2016, Πεκίνο, Κίνα). Παράλληλα, το έγκυρο παγκόσμιου κύρους ιατρικό περιοδικό Pathology International (in PubMed) της Ιαπωνικής Εταιρίας Παθολογικής Ανατομικής, εκτιμώντας την καινοτομία και εφαρμοσιμότητα του εγχειρήματος στην Κυτταρολογία ενέκρινε τη δημοσίευση του ακόλουθου άρθρου: Tsiambas E., and Riziotis C., "Implementation of a Real-Time Reference and Calibration Grid Platform for Improved Screening - Mapping in Pap test Slides". Pathology International 2017. Στον Ελλαδικό χώρο, πρόδρομα αποτελέσματα έχουν παρουσιαστεί στο "10ο Συνέδριο Ελληνικής Εταιρίας Κλινικής Κυτταρολογίας", καθώς και μετέπειτα αποτελέσματα στην Εκδήλωση Καινοτομίας "Greek Innovation Forum 2016"και στη  Διεθνή Έκθεση Θεσσαλονίκης (ΔΕΘ 2015 και 2019) στο εκθεσιακό περίπτερο της Γενικής Γραμματείας Έρευνας και Τεχνολογίας.

Το καινοτόμο πλέγμα που αναπτύχθηκε δρα ως προσανατολιστικός μηχανισμός κατά τη διαδικασία της μικροσκόπησης και δύναται να εντοπίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια στην περιορισμένη επιφάνεια του κυτταρολογικού πλακιδίου σε πραγματικό χρόνο (real-time) το σύνολο των κυτταρικών αλλοιώσεων οδηγώντας σε αναβαθμισμένη ερμηνεία τους σε σχέση με την απλή συμβατική μικροσκόπηση. Παράλληλα, δίνει τη δυνατότητα στον Κυτταρολόγο να επανέλθει με ακρίβεια και ασφάλεια σε σημεία ενδιαφέροντος που απαιτούν ταχεία δεύτερη μικροσκόπηση και να τα χαρτογραφήσει. Δεν απαιτούνται πολύπλοκα και ακριβά συστήματα ψηφιακής καταγραφής ή σάρωσης καθώς το πλέγμα "αλληλεπιδρά"άμεσα με τον Κυτταρολόγο οξύνοντας την παρατηρητικότητα του και προσαρμόζοντας τη διαγνωστική του εμπειρία κατά τη διαδικασία της μικροσκόπησης. Σύμφωνα με τον  Κυτταρολόγο-Ερευνητή Δρ. Ευάγγελο Τσιάμπα, υπεύθυνο για τη διαγνωστική εφαρμογή της νέας πλατφόρμας, με βάση τα πορίσματα της μελέτης το άριστο αποτέλεσμα επιτυγχάνεται με το συνδυασμό του πλέγματος και κυτταρολογίας υγρής φάσης (liquid based cytology) η οποία προσδίνει στο πλακίδιο καθαρό υπόστρωμα μικροσκόπησης και ταξινομημένα διακριτά κύτταρα ή μικρές ομάδες κυττάρων σε περισσότερους "κενούς"χώρους.

Σύμφωνα με την κατατεθειμένη αίτηση ευρεσιτεχνίας το πλέγμα δύναται να κατασκευασθεί με διάφορους τεχνικούς τρόπους μικρό-εγχάραξης (συμπεριλαμβανομένων τεχνικών μικρομηχανικής με Laser) σε διάφορες πλατφόρμες υλικών, παρέχοντας τα επιθυμητά οπτικά χαρακτηριστικά για μικροσκοπική χρήση. Στην ομάδα του Ερευνητή ΕΙΕ Δρ. Χρήστου Ριζιώτη οργανώνεται η επέκταση της έρευνας για αποτύπωση των πλεγμάτων σε εναλλακτικά υλικά όπως ειδικές βιοσυμβατές πολυμερικές ταινίες υψηλής διαφάνειας και αντοχής έτσι ώστε να καταστεί δυνατή τεχνολογικά η μαζική βιομηχανική παραγωγή των πλεγμάτων και με ελάχιστο κόστος και κατά συνέπεια η ανταγωνιστική εφαρμογή τους σε ευρεία κλίμακα στην διαγνωστική Κυτταρολογία ή Παθολογοανατομία. Να σημειωθεί ότι η διάταξη του πλέγματος δεν αλληλεπιδρά άμεσα με το βιολογικό υλικό του πλακιδίου κολποτραχηλικού επιχρίσματος και η τεχνική μικροσκόπησης είναι απόλυτα ασφαλής, διαρκώς αναπαραγώγιμη και συμβατή με τις τρέχουσες διαγνωστικές τεχνικές.

Παρά την πολύ σημαντική αυτή εξέλιξη από τους Έλληνες ερευνητές στη διαγνωστική αναβάθμιση του  PAP TEST, το τελευταίο πρέπει να συνδυάζεται με την κολποσκόπηση, το μοριακό έλεγχο, την ανοσοϊστο-κυτταροχημεία νέων προγνωστικών δεικτών καθώς σύμφωνα με τις σύγχρονες κατευθύνσεις (guidelines) στη διαχείριση της παθολογίας του κολποτραχηλικού συστήματος αυτό λογίζεται ως μια πρόδρομη εξέταση στα πλαίσια του γενικού γυναικολογικού ελέγχου (screening) και όχι ως τελική διάγνωση. Η τελική διάγνωση σε εντοπισμένες από το PAP TEST αλλοιώσεις επέρχεται με την ιστική βιοψία από την πάσχουσα περιοχή. Τα κυτταρομορφολογικά ευρήματα του PAP TEST ταξινομούνται και ερμηνεύονται με βάση το διεθνώς αποδεκτό σύστημα BETHESDA 2001, το οποίο αναβαθμίστηκε το 2014. Σε αντίθεση με το PAP TEST, ο μοριακός έλεγχος ανίχνευσης του HPV (HPV DNA ΤEST) δεν αποτυπώνει σε κυτταρικό επίπεδο την υποτιθέμενη βλάβη του ιού και δε μπορεί να διακρίνει κάτω από το μικροσκόπιο τη σημαντικότητα των αλλοιώσεων, αλλά προσφέρει μόνο τη δυνατότητα ανίχνευσης και τυποποίησης των στελεχών του με τους περιορισμούς που θέτει επίσης η ποιότητα και ποσότητα του ληφθέντος δείγματος. Από τα ανωτέρω κρίνεται με εμφατικό τρόπο κατανοητό ότι το PAP TEST συνεχίζει να αποτελεί την εύκολα διαχειρίσιμη πρωτόλεια βάση για τον έλεγχο της γυναικολογικής υγείας και με την προτεινόμενη τεχνολογία μεγιστοποιεί το ρόλο του σε αυτή. 

Η ανάπτυξη της τεχνολογία πλέγματος αποτελεί ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα του πως μια διεπιστημονική συνεργασία τεχνολογίας και ιατρικής επιστήμης μπορεί να επιτρέψει την μετουσίωση μιας απλής ιδέας σε ένα ισχυρό διαγνωστικό εργαλείο με σημαντικό αντίκτυπο στην καθημερινή ιατρική πράξη.

Η ερευνητική ομάδα ανάπτυξης της εν λόγω εφεύρεσης φιλοδοξεί αυτή να εξελιχθεί σε ένα προϊόν μαζικής βιομηχανικής παραγωγής με σημαντική αξία στην κυτταρολογική πρακτική παγκοσμίως. Λίαν προσφάτως και για πρώτη φορά εφαρμόσθηκε το πλέγμα ανίχνευσης πιλοτικά και ερευνητικά για τον προσδιορισμό ανοσοχρωσμένων χαρακτηριστικών κυττάρων με βιοδείκτες (με διεθνή δημοσίευση και βράβευση με το πρώτο ΒΡΑΒΕΙΟ σε μεγάλο ιατρικό Συνεδριο -27^ο ΙΣΕΔ, Θεσνικη Οκτ 2018)., ενώ επίσης για πρώτη φορά δημοσιεύτηκε η εφαρμογή του σε πλακίδια χρωμογόνου in situ υβριδισμού (CISH) για τη συστηματική και απρόσκοπτη παρατήρηση και μέτρηση ανοσοχρωσμένων στιγμάτων γονιδίων και χρωμοσωμάτων. Το γεγονός αυτό προσθέτει ασφάλεια και αξιοπιστία στη συνολική καταγραφή και υπολογισμό του λόγου τους (ratio) μέσα στο πυρηνικό περιβάλλον καθώς αυτός σηματοδοτεί την ορθολογική επιλογή ασθενών πχ με καρκίνο μαστού βάσει μοριακών κριτηρίων για την εφαρμογή στοχευμένων θεραπευτικών ογκολογικών πρωτοκόλλων. Παράλληλα, συστάθηκε υπό την αιγίδα του ΕΙΕ και τη σύμφωνη γνώμη των ερευνητών ειδική ομάδα εργασίας που στοχεύει στην άμεση επένδυση της πατέντας για την ανάπτυξη του τελικού ιατροβιοτεχνολογικού προιόντος (hi-tech καλυπτρίδες με ενσωματωμένο πλέγμα μικροσκόπησης), καθώς υπάρχει εξαιρετικό ενδιαφέρον επιστημονικό και οικονομοτεχνικό. Το πλέγμα έχει παρουσιαστεί σε πόλλες επιστημονικές ημερίδες και συνέδρια ενώ η ΕΤ1 πραγματοποίησε μέσω της εκπομπής «ΜΕ ΑΡΕΤΗ ΚΑΙ ΤΟΛΜΗ» την πρώτη δημόσια παρουσίαση της στα τηλεοπτικά δρώμενα.

References

1. Riziotis C., Tsiambas E., "Reference and Calibration Grid for Improved Real Time Detection of Biological Entities in Microscopy Diagnostic Techniques," ("Πλέγμα αναφοράς και βαθμονόμησης για βελτιωμένη ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο βιολογικών οντοτήτων σε τεχνικές διαγνωστικής μικροσκοπίας") Patent ID 1008931/2017, Hellenic Industrial Property Organization.
2. Riziotis C., Tsiambas E., "Reference and Calibration Grid for Medical Diagnostic Microscopy", Patent ID WO 2017/009673 A1.
3. Riziotis C., Tsiambas E., "Grid-based visual aid for enhanced microscopy screening in diagnostic cytopathology", SPIE/COS Photonics Asia. Proc. SPIE 10024, Optics in Health Care and Biomedical Optics VII, 100244M (2016)
4. Tsiambas E., and Riziotis C., Implementation of a Real-Time Reference and Calibration Grid Platform for Improved Screening - Mapping in Pap test Slides. Pathol Int 2017; 67(1): 24-31
5. Kyrodimos E, Papanikolaou V, Tsiambas E, Kikidis D, Peschos D, Ragos V, Mastronikolis N, Riziotis C, Chrysovergis A. Cyclin D1 Gene Numerical Imbalances in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma: A Tissue Microarray Grid Based Analysis. Asian Pac J Cancer Prev. 2020 ;21(2):379-384
6. Tsiambas E, Riziotis C, Mastronikolis NS, Peschos D, Mortakis A, Kyroysis G, Mastronikolis SN, Batistatou A, Lazaris AC, Patsouris E, Ragos V. Comparative p16_IKN4A Expression in Laryngeal Carcinoma and Cervical Cancer Precursors: A Real-time Grid-based Immunocytochemistry Analysis. Anticancer Res. 2018;38(10):5805-5810.
7. Tsiambas E, Riziotis C, Mavrikos I, Armatas E, Patsouris E. Novel techniques for morphometric and geometrical analysis in squamous intraepithelial lesions on cervical smears. J BUON. 2017;22(4):1081-1083.

Ο κ. Ευάγγελος Τσιάμπας και ο κ. Χρήστος Ριζιώτης είναι επιστημονικά υπεύθυνοι του Διπλώματος Ευρεσιτεχνίας